De invloed van temperatuur op de fermentatie van gist

• Netbook - Asus EEEPc

• Vernier Go!Link Interface

• Vernier Druk meter (GPS-BTA)

• Spreadsheet voor data analyse

• Bakkersgist

• Druivensuiker

• Bekerglas (600 ml)

• Water

• Pipet

• Balans

• Maatcylinder

• Olijfolie

• Thermometer

• Statief met klem

• Warmhoudplaatje

• Reageerbuis met doorboorde stop

• Maak een gist suspensie door een zakje bakkersgist te suspenderen in 100 ml (7%) ca. 1 uur voordat het experiment uitgevoerd wordt.

• Maak een 5% glucose oplossing in water.

• Bouw de opstelling op

• Verbindt een pastic slang via een plug met een doorboorde stop aan een kant en aan de andere kant met de gas druk sensor.

• Verbindt de sensor met de Go! Link.

• Verbindt de Go! Link met de EEEPc.

• Start de Go! Link software op.

• Stel deze in op een meting van 30 minuten met 10 metingen per minuut.

• Maak een waterbad klaar mbv het bekerglas.

• Men kan het waterbad plaatsen op een warmhoudplaatje, men kan het voor de helft vullen met ijs en men kan bij kamertemperatuur werken.

• Meet de temperatuur van het water gedurende het experiment.

• Meng de gistsuspensie goed op.

• Neem 3 ml met een pipet en pipetteer deze in de reageerbuis.

• Neem 3 ml glucose oplossing en pipetteer deze in de reageerbuis.

• Meng goed.

• Plaats ca. 2-3 ml olijfolie boven op het mengsel.

• Plaats de reageerbuis in het waterbad en klem deze vast mbv het statief.

• Wacht gedurende 10 minuten waarbij de stop nog niet op de buis geplaatst is.

• Plaats na 10 minuten de stop op de buis en start de meting.

• Als de meting afgelopen is "save" dan de data.

• Exporteer de dataset vervolgens als tekst file.

• Importeer de data in Excel  en analyseer deze.

In onderstaande grafiek is het resultaat van de experimenten weergegeven als een druk vs tijd diagram voor de verschillende metingen. Bij enkele metingen hebben we i.p.v. 30 minuten, 60 minuten lang gemeten.

Het resultaat is ook beschikbaar als Excel file (2007): analyse.xlsx

Deze grafiek laat eigenlijk alleen maar zien dat er bij een hogere temperatuur meer druk dus meer CO₂ geproduceerd wordt. De gist is dan actiever. Bij een te lage temperatuur is er nagenoeg geen enkele vergistings activiteit.  Volgens de literatuur zou de fermentatie snelheid stijgen bij temperaturen van 10 to 40 oC en bij 50 oC en daarboven weer afnemen.

In de reageerbuis hebben we 3 ml 5% glucose oplossing gemengd met 3 ml gist suspensie. Het totaalvolume is dan 6 ml.
Voor een 5% glucose oplossing geldt: 5% = 5 g/100 ml = 50 g/l = 50/180.16 mol/l = 0.28 M glucose. Deze wordt met een factor 2 verdund hetgeen betekent dat op t=0 de glucose concentratie overeenkomt met 0.14 M.

De bruto reactievergelijking waar we in dit vergistingsproces mee te maken hebben luidt: C₆H₁₂O₆ --> 2 CH₃CH₂OH + 2 CO₂ + energie
! mol glucose levert dus 2 mol ethanol en 2 mol CO₂.

De productie van CO2 leidt tot de druktoename die we meten met de drukmeter. Volgens de gaswet (pV=ZnRT) is mol productie van CO2 dus recht evenredig met de druktoename. De snelheid van de druktoename is dientengevolge een maar voor de reactiesnelheid en deze kunnen we uit bovenstaande grafieken afleiden door de hellingshoek te bepalen in een lineair deel van de grafiek (r = DP/Dt). Het resultaat is weergegeven in nevenstaande tabel en onderstaande grafiek.

Het liefst hadden we meer datapunten gehad in deze grafiek (andere temperaturen) maar aangezien we maar beperkte mogelijkheden hebben om de temperatuur constant te houden is dat niet gelukt. Ik heb dit wel geprobeerd door metingen uit te voeren terwijl het waterbad af een het koelen was of op aan het warmen en vervolgens de gemiddelde waarde te nemen, maar dit werkte niet goed.
 

Temperatuur veranderingen hebben een sterk effect op levende organismes. Vooral enzym gekatalyseerde reacties zijn bijzonder gevoelig voor kleine veranderingen in de temperatuur. Om deze reden wordt het metabolisme van de poikilothermen (organismes waarvan de interne lichaamstemperatuur bepaald wordt door hun omgeving) bepaald door hun omgevingstemperatuur. Van deze eigenschap die gisten hebben maakt men dan weer gebruik van bij bakkersgist. De door het bakkersgist geproduceerde CO₂ zorgt ervoor dat het brood gaat rijzen en zo luchtig wordt.

De vergistingreactie die we hier bestudeerd hebben is uitgevoerd onder anaerobe condities, onder uitsluitsel van zuurstof, waarbij de glucose moleculen omgezet worden in ethanol, CO2 en energie volgens:
 

Reactievergelijking: C₆H₁₂O₆ --> 2 CH₃CH₂OH + 2 CO₂ + energie

De geproduceerde energie komt overeen met 2 ATP moleculen.

Reactievergelijking: C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ --> 6 H₂O + 6 CO₂ + energie
De geproduceerde energie komt dan overeen met 36 ATP moleculen.

In deze reactie zouden we echter geen drukverandering waarnemen aangezien het netto effect van productie en afname van gasmoleculen 0 is.
 

• Een toename in temperatuur gaat gepaard met een toename in reactiesnelheid bij de fermentatie van glucose met bakkersgist.

• A. Meesters, B.H. Jurgens, W.P. Postma, W.J. Prud'homme van Reinde; "Practicum Biologie"; Meulenhoff; 1970: ISBN 9023140206; p. 21-53.

• D.G. Mackean; "Inleiding tot de biologie"; 6de druk; Wolters-Noordhoff; 1969; ISBN 9001568009; p. 60, 92.

• David Dressler, Harrington Potter; "Enzymen Gangmakers in de natuur"; Natuur & Techniek; 1992; ISBN 9070157993; p. 23-37.

• Octave Levenspiel; "The Chemical Reactor Omnibook"; 1979; ISBN 0882460676; p. 81-1 - 84-11.

• F. Roelandse; 'Alcoholische gisting'; DJO; 1975 5; blz. 128-130.

• Allan Jones, Rob Reed and Jonathan Weyers; 'Practical Skills in Biology'; Addison Wesley; 1994; ISBN 0582066999; blz. 149-152, 159-164.

• Lubert Stryer; 'Biochemistry'; Freeman; 1975,1981, 2nd Ed.; ISBN 0716712261; p. 103-134.

• H.Scott Fogler; 'Elements of Chemical Reaction Engineering'; Prentice-Hall; 1986; ISBN 013263666; blz. 328-337.

• Larry N. Reinking, Jeffrey L. Reinking, Kenneth G. Miller; 'Fermentation, Respiration & Enzyme Specifity: A Simple Device & Key Experiments with Yeast'; The American Biology Teacher; 56 3 1994; p. 164-168.

• Men kan dit experiment uiteraard ook met CoachLab uitvoeren.

• Man kan i.p.v. druivesuiker ook een oplossing (20%) van gewone rietsuiker gebruiken, omdat gistcellen een enzym afscheiden dat de rietsuker in glucose en fructose splitst.

• De olie zorgt ervoor dat zuurstof uit de lucht die in de regeerbuis zit de oplossing binnenkomt. Op deze manier blijft het reactiemengsel anaerobisch. Ook zorgt het er voor dat het water niet verdampt en het volume van het systeem dus constant blijft.

• Google zoektermen:
  Nederlands: Gist, Vergisting, Fermentatie, Bakkersgist
  Engels:Yeast, Fermentation, Baker's Yeast
  Duits: die Hefe, Hefekeim, Garen

Gisting

Gisting is het proces waarbij energie uit voedsel wordt vrijgemaakt door een chemisch proces waarbij geen zuurstof aan te pas komt. Het voedsel, bv een koolhydraat, wordt niet volledig afgebroken tot CO2 en H2O maar, tot kleinere organische moleculen zoals alcohol, melkzuur of boterzuur. Aangezien de afbraak onvolledig is komt er bij gisting (anaeroob) minder energie vrij dan bij ademhaling (aeroob). Gisting en ademhaling kunnen tegelijkertijd in dezelfde cel plaatsvinden. Tijdens hevige spieractiviteit kan de zuurstofvoorziening wel eens onvoldoende zijn om alle voedsel te oxideren en aan de energiebehoefte te voldoen. Dan wordt er energie vrijgemaakt uit glucose door de melkzuurgisting:

1 mol glucose --> 2 mol melkzuur + 76 kJ

Dit melkzuur wordt geoxideerd tot of weer in koolhydraat omgezet nadat de hevige activiteit is afgelopen; dus de zuurstof-opname gaat nog een tijdlang extra snel (nahijgen). Men zegt dat organisme een ''zuurstofschuld" heeft t.g.v. van de gisting.
Bepaalde bacteriën, zoals de melkzuurbacteriën (waaraan we zure melk, karnemelk, yoghurt en zuurkool danken) en schimmels krijgen al hun energie, of een groot deel ervan uit gisting. Sommige van deze bacteriën kunnen zelfs niet ademen, en zuurstof is vergif voor ze.

Alcoholische vergisting op industriële schaal wordt meestal teweeggebracht door gisten die inwerken op suikeroplossingen zoals vruchtensap en mout:

C₆H₁₂O₆ --> 2 CO₂ + 2 C₂H₅OH + 118 kJ

Als de gistingsproducten, in dit geval alcohol, niet verwijderd worden, bereiken zij een concentratie waardoor het gistend organisme gedood wordt. Vandaar dat wijn nooit sterker kan zijn dan 13% alcohol.

Bij het bierbrouwen laat men eerst gerst ontkiemen en hierbij wordt het zetmeel omgezet in maltose. De kiemende gerst wordt gedood en de maltose wordt er met water aan onttrokken. Aan deze oplossing wordt gist toegevoegd, die de omzetting tot alcohol en koolstofdioxide veroorzaakt. Bij het maken van bier wordt hop toegevoegd om er een bittere smaak aan te geven. en de vloeistof wordt dan onder druk gebotteld zodat het CO2 behouden blijft.

Veel vruchtensappen gisten spontaan als men de stuk gedrukte vruchten in daartoe geëigende omstandigheden laat staan en de gistplekken die op de schillen aanwezig zijn, zich laat ontwikkelen. Als er teveel zuurstof wordt toegelaten of als er de verkeerde gistsoorten, samen met fungi en bacteriën, erin komen, dan kan de oxydatie van de alcohol doorgaan totdat er azijnzuur wordt gevormd, zoals in azijn.

Bij het bakken wordt gist gebruikt om voor het bakken het deeg te laten "rijzen" door de koolstofdioxide belletjes die afgegeven worden.

Door de vitaminen van het B-complex die erin aanwezig zijn, is de gist zeer waardevol bij de genezing van vitamine-tekorten.

Gisten

De gistsoorten vormen een zeer ongewone familie der fungi. Slechts enkele van de talrijke soorten kunnen echte zwamdraden vormen; de meeste bestaan uit afzonderlijke, bolvormige cellen, die men slechts onder de microscoop kan zien.

Gisten zijn eencellige micro-organismen met een grootte van circa 0,005-0,020 mm. Anders dan bacteriën hebben gistcellen hun DNA in de celkern opgeborgen; dat hebben zij gemeen met planten, dieren en mensen, waardoor zij ingedeeld zijn bij de eukaryote organismen.

De gistcellen zijn opgebouwd uit een dunne celwand die het protoplasma omsluit. In het midden van het protoplasma bevindt zich een vacuole. Een speciaal protoplasmakorreltje, de nucleolus, is hieraan bevestigd en men neemt aan dat deze beide delen, vacuole en nucleolus, de kern vormen. In het protoplasma liggen korreltjes glycogeen en ander reservevoedsel.

De cellen planten zich voort doos spruiting of knopvorming, waarbij een uitstulping van de cel groter wordt en ten slotte als een onafhankelijke cel van de  ouderplant wordt afgesnoerd. Als de knopvorming niet snel plaatsvindt, laten de afzonderlijke cellen niet direct los en het gevolg hiervan is, dat men soms groepjes aan elkaar vastzittende cellen kan zien.

Onder bepaalde omstandigheden kunne twee cellen copuleren dwz ze verenigen zich en de inhoud van de beide cellen versmelt. Later deelt  deze celinhoud zich in vier afzonderlijke cellen die elk een dikke wand ontwikkelen. Dit zijn sporen en ze kunnen een ruststadium vormen. Als de oude celwand die ze omsluit, openbreekt, komen de sporen vrij en groeien uit to normale, knopvormige cellen. Zulke sporen ontstaan dikwijls zonder enige voorafgaande copulatie.

Enzymkinetiek

De vergistingsreactie verloopt aangezien er enzymen aangemaakt worden die ervoor zorgen dat de reacties kunnen verlopen.

Een enzym is een eiwit met katalytische eigenschappen, vanwege hun vermogen om specifieke bindingen te activeren (de activeringsenergie wordt verlaagd).

Een enzym heeft naast een eiwitgedeelte (het apo-enzym) vaak nog een andere bouwsteen (de cofactor) nodig voor de katalyserende functie. Het geheel noemt men holo-enzym.

Als cofactor kunnen optreden metaal-ionen (bv Ca²⁺) of een complex organisch molecuul dat als coenzym functioneert bv NADH

De enzymkinetiek gedraagt zich niet wezenlijk anders dan de normale chemische kinetiek. Vaak heeft men te maken met pseudo-1^ste-orde kinetiek (bv als in een 2^de orde reactie een de concentraties zeer hoog is en de andere concentratie zeer laag).

In een 1^ste orde reactie is de reactiesnelheid evenredig met de concentratie van een reactant.

Voor de reactie: S --> P

Geldt dan:

dus

Hieruit volgt ook dat de concentratie van P gemakkelijk te berekenen is volgens:

[P] = [S]₀ – [S] (waarin [S]₀ de concentratie van S op tijdstip t=0 is).

Het concentratieverloop is grafisch weergegeven in onderstaande figuur.

Bij een enzymatische bepaling laat men het enzym enige tijd inwerken op het substraat en bepaald men de substraat (S) of product (P) concentratie op verschillende tijdstippen (of continue). De kromme die het verband weergeeft tussen bv de hoeveelheid omgezet substraat (de conversie) en de tijd, noemt men de progress-curve.

We kunnen in de progress-curve zien dat de conversie van S steeds verder van de raaklijn afwijkt. Voor deze afwijking zijn verschillende oorzaken mogelijk:

• De concentratie van S neemt af en de reactie verloopt volgens de 1^ste orde kinetiek

• De concentratie van P neemt toe, zodat bij een reversibele reactie, de omgekeerde reactie steeds sneller loopt.

• Het gevormde P remt soms de reactie (negatieve feedback).

• Het enzym wordt minder actief door denaturatie.

Om van deze afwijking geen last te hebben moet men dus meten rond t=0.

Het effect van de verschillende enzymconcentraties kan nog duidelijker zichtbaar gemaakt worden door de reactiesnelheid (de omgezette hoeveelheid per tijdseenheid) als functie van de enzymconcentratie uit te zetten. Door het maken van zulk een curve kan men zien dat alleen op t=0 er een lineair verband bestaat tussen de enzymwerking (reactiesnelheid) en enzymhoeveelheid. De juiste reactiesnelheid wordt dus gevonden door op t=0 de raaklijn aan de progress-curve te trekken. Deze reactiesnelheid noemt men de initial velocity (v₀).

Er zijn een aantal factoren die van invloed zijn op de reactiesnelheid (initial velocity):

• de enzymconcentratie [E]

• de substraatconcentratie [S]

• de pH

• de temperatuur

• remmers (inhibitoren) en aktivatoren

In 1913 ontwikkelden L.Michaelis en M.Menten (MM) een algemene theorie over de werking van enzymen. Briggs en Haldane breidden deze theorie later uit. Deze uitbreiding staat bekend onder de naam steady-state theorie. De MM theorie vormt de basis van de kwantitatieve analyse van alle aspecten van enzymkinetiek en inhibitie en is het best ontwikkeld voor een (1) substraat. De MM theorie gaat er van uit dat een enzym E met het substraat S een enzymsubstraat complex ES vormt dat in een tweede stap uiteenvalt in vrij enzym E en product P (beide reacties zijn reversibel). De MM vergelijking afgeleid volgens de steady-state theorie geeft het mathematische verband tussen de initial velocity, de concentratie S en enkele karakteristieke kenmerken van een enzym.

Reactie:

Symbolen:

• e = totale concentratie enzym

• p = concentratie ES ( dus e-p = concentratie vrije enzym !)

• s = concentratie vrije substraat

• v_o = initial velocity (beginsnelheid)

• k = reactieconstante

Volgens de steady state theorie is de vormingssnelheid van ES gelijk aan de ontledingssnelheid.

De vormingssnelheid van ES: (1)

Hier verwaarlozen we de terugvorming uit P aangezien op t=0 geldt P=0.

De ontledingssnelheid van ES: (2)

(1) = (2) ==>   (3)

Dus: (4)

De initial velocity (reactiesnelheid op t=0) wordt bepaald door de productvorming uit ES:

(5)

(4) in (5) geeft: (6)

De maximale reactiesnelheid (V_max, S à ) wordt dan: (7)

De constante (8) noemt men de Michaelis-Menten constante.

Dus (7) en (8) in (6) geeft de Michaelis-Menten vergelijking:
 

Consequenties:

1. s is laag à 1 is verwaarloosbaar t.o.v. Km/s à
   V₀ is evenredig met S (1^ste orde).

2. s is zeer hoog à Km/s te verwaarlozen t.o.v. 1 à
   V₀ onafhankelijk van s (0^de orde).

3. V₀ = ½ V_max à

   K_M is dus gelijk aan de substraatconcentratie die aanleiding geeft tot een initial velocity die gelijk is aan ½ V_max.

De vorm waarin de MM vergelijking is gegoten is onhandig om uit de experimentele gegevens K_M en V_max te bepalen. Daarom heeft men deze vergelijking getransformeerd naar een lineaire vergelijking (door de reciproke te nemen) waarmee men de Lineweaver-Burk plot kan verkrijgen (die een rechte lijn geeft als men 1/v₀ t.o.v. 1/s uitzet).

Helling = K_M/V_max Snijpunt y-as = 1/V_max Snijpunt x-as = -1/K_M